前言
免疫检查点阻断疗法（Checkpointblockadeimmunotherapy，CBI）通过抑制限制T细胞活化和效应功能的分子（如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)和PD-1）与其配体之间的相互作用，增强抗肿瘤免疫反应。这使得一部分癌症患者的长期无进展生存率得以提高，改善其预后不佳。然而，免疫检查点只是其调节机制系统的一个组成部分，这些调节机制在肿瘤微环境中协同作用，拮抗免疫介导的恶性细胞消除。将CBI的益处扩展到更多的患者可能需要同时针对其他免疫调节机制。T调节（Tregulatory，Treg）细胞的活动构成了另一层免疫调节，包括调节抗原呈递细胞功能、分泌抑制性细胞因子和消耗T细胞存活因子。因此，靶向Treg细胞的方法是改进癌症治疗的一个重要方面。
Foxp3+T调节（Treg）细胞可促进肿瘤免疫耐受，但其免疫抑制功能如何在肿瘤微环境中被调节尚不清楚。美医院ThorstenR.等研究人员采用活体显微技术，揭示了为肿瘤浸润的Treg细胞提供关键激活信号的细胞相互作用。研究发现多克隆Treg细胞库可预先富集以识别肿瘤相关常规树突状细胞（conventionaldendriticcells，cDCs）呈递的抗原。不稳定的cDC接触足以维持Treg细胞的功能，而T辅助细胞则在稳定的相互作用中被激活。接触不稳定性由cDCs上共刺激B7家族蛋白的CTLA-4依赖性下调所引起，并由Treg细胞自身介导。CTLA-4阻断促使肿瘤微环境中CD28依赖性Treg细胞的过度增殖，同时需要伴有Treg细胞的失活以实现肿瘤排斥。因此，Treg细胞通过CTLA-4-和CD28依赖的反馈回路进行自我调节，该回路可将其种群大小调整至局部共刺激的数量。CTLA-4阻断引起的回路破坏可能会抵消对癌症患者的治疗效果。
Treg细胞的多克隆TCR库为应对肿瘤而富集
为检测肿瘤组织中Treg细胞活化的单细胞动力学，研究者使用体内成像方法，选择活化T细胞核因子（nuclearfactorofactivatedTcell，NFAT）调节域和GFP(‘‘NFAT-GFP’’)的融合体作为产生的T细胞抗原受体（Tcellantigenreceptor，TCR）结合的荧光报告分子。NFAT-GFP在形成同源APC联系后1-3分钟内，在CD8+T细胞的核内积累，在停止联系后以20分钟的半衰期重新分布到细胞质中。本研究用双顺反子逆转录病毒载体表达NFAT-GFP和荧光组蛋白融合蛋白H2B-RFP作为基因编码的核标记物，激活并转导从C57BL/6小鼠二级淋巴器官（SecondaryLymphoidOrgans，SLOs）中纯化的CD4+Foxp3+Treg细胞，以CD4+Foxp3-Th细胞作为参照。6天后，Treg细胞表达Foxp3而Th细胞不表达，并且两者均表达NFAT-GFP和H2B-RFP。然后将这些细胞分别静脉注射到受亚致死量照射的CD11cmCherry报告小鼠体内。
6周后，将表达蓝色荧光组蛋白H2B-Cerulean融合蛋白的MC38结肠瘤（MC38H2B-Cer）移植到小鼠背部皮下，该模型中的Treg细胞强烈抑制抗肿瘤免疫。体外TCR激活导致SLO归巢受体CCR7的丢失，以及转运受体的增加以便迁移到炎症组织，使Treg和Th细胞能够直接浸润肿瘤组织，并绕过肿瘤引流淋巴结（TumordrainingLymphnodes）tdLNs中的抗原启动要求。因此，在肿瘤植入后第6天，研究人员在肿瘤周围安装背部皮窗以便进行MP-IVM分析，发现注射的Foxp3+Treg细胞和Foxp3-Th细胞已经在肿瘤中积累。4-5天后，通过肿瘤细胞核蓝色荧光证实在肿瘤实质和周围基质中均存在Treg细胞。距离较近或直接与CD11c-mCherry+APCs接触的Treg细胞运动能力减弱，NFAT-GFP从胞质被重新分布到细胞核。与Treg不同的是，几乎所有的Th细胞均以更快的速度迁移，没有停滞，也没有在细胞核中频繁蓄积NFAT-GFP。这表明，大多数Th细胞不识别抗原，这与研究者的假设一致，即多克隆体外激活过程中诱导归巢受体表达，使转移的Th和Treg细胞主要被招募到肿瘤微环境中。
传统的DC激活了肿瘤微环境中的Treg细胞
研究人员将表达NFAT-GFP的Treg细胞转移到骨髓移植3周后，T细胞还没有完全建立起来的骨髓嵌合体小鼠（BoneMarrowChimeramouse，BMCs）中，以提高其植入能力。又经过3周后，移植了MC38H2B-Cer肿瘤，并给予动物白喉毒素（DiphtheriaToxin，DT）或溶媒加以治疗。溶媒组动物肿瘤浸润Treg细胞的MP-IVM分析显示出与上述类似的细胞运动抑制和NFAT核内蓄积。与之相反，DT处理的小鼠Treg细胞的迁移不受限制，NFAT激活事件的频率从大约三分之一降低到6%-7%。因此，肿瘤微环境中局部TCR依赖性Treg细胞的激活主要依赖于cDC的抗原递呈。
为了研究NFAT通路与瘤内Treg细胞维持的关系，研究人员在Foxp3creERT2×CnBf/f小鼠的侧翼皮下移植了MC38肿瘤。这使得他莫西芬诱导的钙调磷酸酶(CnB)的调节性B亚基缺失，而CnB是TCR诱导NFAT活化所必需的。Treg细胞的CnB缺失并同时采用FTY治疗后，肿瘤中Treg细胞数量降低，Foxp3表达减少，增殖降低，CTLA-4表达减少，而ICOS水平保持不变。
Treg细胞降低瘤内APC与Th细胞的接触稳定性
研究人员从HA-TCR转基因小鼠（流感血凝素，InfluenzaHemagglutinin，HA）和共表达HA自身抗原的HA-TCR小鼠中分别分离纯化了HA特异性CD4+Th细胞和Foxp3+Treg细胞。二者均在体外激活，转导共表达NFAT-GFP和H2B-RFP后，注射入经亚致死性照射的CD11cmCherry与BALB/c杂交小鼠中。6周后，将表达H2B-Cerulean的CT26HA肿瘤(CT26HAH2B-Cer)移植入小鼠体内，并安装背部皮窗以进行MP-IVM分析。肿瘤微环境中的HA特异性Treg细胞与MC38肿瘤中的多克隆Treg细胞行为相似：NFAT-GFP与CD11c-mCherry+APCs接触后迅速积聚在细胞核内，在部分稳定接触时保留下来，当Treg细胞游离并离开APCs时缓慢迁移到细胞质中。相比之下，HA特异性Th细胞在APC完全稳定接触时，大部分时间在细胞核内积累NFAT-GFP，并且比HA-Treg细胞维持这些接触的时间更长。然而，HA-Treg细胞和HA-Th细胞之间NFAT激活的总体速率相似，这表明它们对共享同源抗原的暴露和敏感性是相似的。尽管HA-Treg细胞和HA-Th细胞的行为相似，但HA-Treg细胞信号片段的持续时间更短，迁移更快，所受阻滞更少。
Treg细胞可能通过改变DC递呈抗原的方式，使自身免疫系统中Th细胞与淋巴结的相互作用变得不稳定。因此，研究人员猜测Treg细胞也会改变肿瘤相关APCs递呈抗原的方式，从而降低其自身APC相互作用以及与效应T细胞的稳定性。为了验证这个假设，作者不仅给小鼠注射了表达NFAT-GFP的HA-Th细胞，还注射了无荧光的HA-Treg细胞。结果表明，Treg和Th细胞与肿瘤组织中APC相互作用的差异主要是由Treg细胞进入肿瘤微环境的变化所引起的。这些变化可能包括APC功能的改变，这将导致APC与Th和Treg细胞的接触均不稳定。
CTLA-4阻断增加肿瘤相关cDCs的共刺激配体密度
为了阻断CTLA-4的功能，并检测短期内对MC38肿瘤中CD80和CD86表达的影响，研究者使用了CTLA-4抗体UC10-4F10-11(4F10)。用4F10预处理脾细胞阻断了CD80-和CD86-FC嵌合体与Treg细胞的结合。因此，由于单次静脉注射4F10可使肿瘤浸润Treg细胞上CTLA-4的体外单克隆抗体染色减少80%，研究者估计它体内阻断CD80/CD86的结合也能达到这个程度。值得注意的是，4F10注射并没有降低肿瘤组织中Treg细胞的频率，这表明它不会引起Fc受体依赖性的耗竭。CTLA-4阻断后24h，肿瘤组织中表达IRF8的cDC1增加了CD80和CD86的表达，其程度与DT处理后1天的小鼠Treg细胞消融相似。为了研究增强的共刺激如何影响肿瘤微环境中的Treg细胞，研究者通过第二次注射4F10以延长CTLA-4的阻断时间，同时通过FTY处理中断tdLN中T细胞的补充。在6天之内，与对照组相比，肿瘤组织中Treg细胞的数量增加了一倍以上，并且其增殖率也随之上升，而Foxp3、ICOS和GITR的表达却没有发生变化。
Treg细胞通过CTLA-4反式调节其瘤内种群大小
为了确定CTLA-4通过顺式还是反式作用来控制肿瘤相关Treg细胞增殖，研究人员将CD45.2Foxp3creERT2×Ctla4f/f和CD45.1野生型(WT)供体骨髓移植到CD45.1WT宿主(Foxp3creERT2×Ctla4f/fBMCs)中，制备成混合辐照的BMCs。经过三苯氧胺处理，使一部分Treg细胞快速实现CTLA-4缺失。如果CTLA-4发挥顺式作用，即使同一动物体内存在CTLA-4充足的Treg细胞，CTLA-4缺陷细胞的增殖也应该升高。如果CTLA-4发挥反式作用，较多的CTLA-4充足的Treg细胞群应能阻止CTLA-4缺陷细胞的过度增殖。将MC38肿瘤植入这些BMCs，用他莫西芬处理消除一部分Treg细胞中的CTLA-4，再用FTY阻断tdLN中T细胞的进一步招募，与对照BMCs相比，无论在肿瘤微环境中还是在tdLN中，CTLA-4的缺失都不能增加Treg细胞的增殖速度或数量。
IL-2支持肿瘤中Treg细胞的维持，但不能引起其在CTLA-4阻断下的过度增殖反应
为了在功能上测试IL-2在αCTLA-4对肿瘤相关Treg细胞诱导效应上发挥的可能作用，研究者给小鼠注射单克隆抗体以阻断IL-2Ra和IL-2Rb受体链之间的相互作用。事实上，这导致肿瘤微环境和和tdLN中的Treg细胞数量和增殖率降低约50%，表明IL-2维持了SLOs中乃至免疫效应位点如肿瘤微环境的Treg细胞数量。然而，当同时阻断IL-2和CTLA-4时，与不阻断IL-2相比，尽管起始基线较低，Treg细胞增殖速率和数量的增加幅度相同甚至更大。因此，虽然IL-2有助于维持瘤内Treg细胞，但它并不能使αCTLA-4治疗后产生过度增殖反应和扩增。
CTLA-4/CD28的破坏增强Treg细胞-APC相互作用的稳定性及Treg细胞对CBI治疗效果的限制
为了验证肿瘤微环境中观察到的Treg细胞与cDC相互作用的不稳定性是由于CTLA-4介导的cDC上CD80和CD86缺失引起的共刺激减少所致，研究者将MC38H2B-Cer肿瘤移植到Foxp3GFP×CD11cmCherry(F1)报告小鼠体内，通过MP-IVM使肿瘤微环境中Treg细胞与APC的相互作用可视化。结果显示，每个APC与Treg细胞的累计接触时间在4F10注射后数小时内增加了一倍，达到18-20小时。此外，研究者还对每个APC的接触次数和接触时间进行了量化。当考虑所有APC时，在CTLA-4治疗开始后18小时接触频率或持续时间的增加没有达到统计学意义。对这些特定APC周围的Treg细胞的分析结果显示随着时间的推移其接触速度下降，提示αCTLA-4治疗后Treg细胞接触趋于稳定。
Treg细胞利用CTLA-4作为小鼠和人类免疫抑制的核心机制。因此，在抗体阻断CTLA-4之后，Treg细胞可能失去了限制抗肿瘤免疫反应的能力，在这种情况下，它们的增殖显得无关紧要。然而，Treg细胞可以发挥多种抑制机制。为了检测过度增殖的Treg细胞残留的TCR依赖性免疫抑制功能是否限制CTLA-4阻断引起的抗肿瘤治疗效果，研究人员采用他莫西芬治疗荷MC38瘤的Foxp3creERT2×CnBf/f小鼠，通过敲除CnB来抑制Treg细胞的活化。正如先前观察到的，使用4F10抗体的αCTLA-4单一疗法可使MC38肿瘤的进展轻微延迟。据报道，在Treg细胞中诱导CnB缺失也会导致MC38肿瘤的短暂生长停滞，但不会产生排斥反应。然而，4F10治疗与Treg细胞灭活相结合可在超过三分之一的动物身上消除MC38肿瘤。因此，Treg细胞在肿瘤微环境中扩增，但在CLTA-4阻断后失去了一种关键的抑制机制后，继续阻碍CBI的全面治疗效果。
结语与展望
Treg细胞建立肿瘤耐受性的能力取决于它们在肿瘤微环境中的浸润和遇到的局部同源抗原。这表明，在抗原依赖性细胞相互作用期间它们的功能需要通过TCR信号或其他信号继续维持。研究者使用多光子活体显微镜和NFAT激活的荧光报告分子直接观察Treg细胞如何在肿瘤微环境中接收TCR信号。研究人员发现，具有自身免疫活性的多克隆Treg细胞库可被优先预富集以识别肿瘤微环境中的抗原。此外还观察到，与传统的CD4+T辅助细胞在稳定的APC接触中被激活不同，肿瘤浸润的Treg细胞在与传统的树突状细胞，而不是肿瘤相关的巨噬细胞不稳定的短暂相互作用中，可通过瞬时TCR信号持续存在。这种接触不稳定性不是细胞内源性的，而是由于Treg细胞介导的、CTLA-4依赖的cDCs上的CD80和CD86蛋白下调，这将通过CD28限制Treg细胞的共刺激，并控制其在肿瘤内的增殖。通过肿瘤环境中CTLA-4靶向的CBI稳定的Treg细胞与cDC的接触，造成这种负反馈回路的破坏，可促进Treg细胞的增殖，并使效应T细胞过度的局部增殖。在CTLA-4靶向的CBI过程中，Treg细胞中的NFAT信号的失活释放了其抗肿瘤的治疗性功效，这表明肿瘤相关Treg细胞即使在其CTLA-4依赖性免疫抑制功能被破坏的情况下，仍能继续促进肿瘤耐受。
编者：Julie
生物评价中心参考文献：
[1]MarangoniF,ZhakypA,et,al.Expansionoftumor-associatedTregcellsupondisruptionofaCTLA-4-dependentfeedbackloop.Cell..
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